· poliacrilamidaEl gel ha de ser format per monòmer d'acrilamida, material de partida de la polimerització, catalitzador i la barreja de sal i tampó.
· acrilamidai el BIS (N, N'-metilè doble acrilamida) és la matriu de gel en forma de monòmer.
· El persulfat d'amoni inicia el procés de polimerització de l'adhesiu. La formulació de la cola requereix una solució de persulfat d'amoni al 10% preparada en aigua. La major part de la informació indicava la necessitat d'un ús actiu. Tanmateix, la solució al 10% es pot col·locar a 4 ℃ durant diverses setmanes sense una pèrdua d'activitat significativa. Afegiu-hi fins a 10 ml i descarteu-ho quan la cola no s'agregui.
Consell: El percentatge deacrilamidaEn la seqüenciació, la cola i la cola de proteïnes no són el mateix. Si utilitzeu una solució d'acrilamida: BIS prefabricada, assegureu-vos de comprar l'ampolla correcta.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametil etilendiamina) és un catalitzador, en una ampolla marró, col·locada a la nevera. S'afegeix just abans d'abocar-hi la cola.
· El vidre utilitzat en electroforesi de poliacrilamida s'ha de rentar abans i després de cada electroforesi. Després de l'electroforesi, renteu-lo amb un raspall suau i un drap amb aigua calenta i sabó, esbandiu-lo amb aigua destil·lada i deixeu-lo assecar.
· La humitat i la pols poden causar problemes amb el polímer buit. Abans de l'electroforesi, netegeu la placa de vidre amb un netejador de vidres i eixugueu-la amb un raspall suau. Renteu-la amb aigua destil·lada i eixugueu-la bé amb un drap de paper. Esbandir amb etanol al 70% abans d'eixugar amb paper ajuda a netejar i accelerar l'assecat. Afegiu mostres d'acrilamida successivament: BIS, aigua, solució tampó, persulfat d'amoni, TEMED. Agiteu bé i aboqueu-ho immediatament.
No cal desgasificar la poliacrilamida abans de la polimerització. (L'acrilamida solia col·locar-se al buit per eliminar les bombolles perquè l'oxigen inhibeix la polimerització.)
Puntes de mostra de punt d'adhesiu horitzontal.
· Poseu un tros de paper negre a la caixa inferior, amb fons negre, per fer un forat de mostra per veure-hi més clarament.
· tampó ple de dipòsit de cola, just per sobre del col·loide.
· si la vora té llum, enceneu els llums, deixeu que la llum brilli al col·loide. Aboqueu la mostra a la pipeta.
· utilitzant un dispositiu de pipeteig automàtic.
· En 10-200 mu, es pot utilitzar 1 punt mòbil de líquid a la majoria dels punts de la mostra. Per a forats de mostra molt petits (menys de 10 μ1), el capçal de pipeta llarg utilitzat per a la seqüenciació de cola és més convenient.
· pipetejar immersa a la mostra, inhalant fluid que es mou lentament. La mostra pot semblar enganxosa amb glicerina i un bombament ràpid pot arrossegar bombolles d'aire al cap de la pipeta.
· Després d'inhalar mostres amb el capçal de pipetejar, moveu el capçal de fluid suaument per la vora del tub o, netejant el paper, xucleu el capçal de líquid fora de les gotes. Aneu amb compte de no xuclar la mostra.
Col·loqueu la mostra al forat de mostra
· dispositiu de pipeteig per mantenir una mica de pressió, fer que les mostres es moguin lleugerament pel cap de líquid de desbordament.
· el capçal de pipetació inserit al tampó, lleugerament més alt que els forats puntuals, manté una pressió positiva. La punta de la pipeta es pot inserir en un forat petit.
· lentament i constantment, aboqueu les mostres. La punta de la pipeta es col·loca per sobre del forat de la mostra i la mostra s'enfonsarà al forat. Deixeu que la mostra s'enfonsi per omplir el forat de la mostra en comptes d'empènyer cap a dins.
· Un cop l'última gota de mostra amb el cap de líquid, el líquid es mourà cap a la segona cama, aixecarà lentament el moviment del líquid, sortirà del tampó
Com fer un mostreig vertical de cola?
· forats de mostra amb punt de cola vertical formats entre dos trossos de vidre. En una cola molt fina, el cap de la pipeta ni tan sols es pot inserir entre dues plaques de vidre. Compte amb la glicerina! Col·loqueu el cap de la pipeta sobre el forat de la mostra i la mostra s'enfonsarà al forat.
· Assegureu-vos de col·locar la mostra al punt vertical del forat de la mostra de gel d'acil de polipropilè fins que estigui ben esbandit. Renteu l'acrilamida no polimeritzada i l'aigua que pugui aparèixer a la part inferior del forat de la mostra. L'aigua pot fer que el forat de la mostra sigui significativament més petit. Utilitzeu una xeringa de 25 ml o 50 ml i una agulla de calibre 18. Aboqueu-hi el tampó d'electroforesi i renteu amb cura el forat de la mostra.
· Pot ser difícil veure el forat de la mostra, però alhora la resta és fàcil. Si hi ha forats en excés, el tampó de mostra es pot provar amb blau de bromofenol.
Data de publicació: 31 de març de 2023